Pemeriksaan DHF atau Demam Berdarah

       IgG DHF

Metoda     :  ELISA

Prinsip      : IgG DHF yang terdapat pada sampel akan berikatan dengan anti human IgG yang dilekatkan pada well sample. Kemudian ditambahkan HRP konjugat monoclonal antibodi (Mab) sehingga terbentuk senyawa komplek dan melepaskan peroksida yang bereaksi dengan chromogen membentuk senyawa berwarna biru yang intensitasnya sebanding dengan konsentrasi IgG DHF dalam sampel. Reaksi dihentikan dengan penambahan asam sulfat sebagai stop solution sehingga warna berubah menjadi kuning yang dibaca absorbannya dengan alat ELISA Plate Reader pada λ 450 nm dan 620 nm.

Alat dan bahan  :

-          Inkubator

-          ELISA Plate reader

-          Mikropipet 1000 µl, 500 µl, 100 µl, 50 µl dan 5µl

-          Rak well  beserta penutupnya

-          Reagen kit IgG DHF

-          Tip kuning

-          Washing solution

-          Sampel (serum)

Cara Kerja :

a)     Dipipet 1000 µl serum diluent dan 10 µl sampel serum, kontrol negatif, kontrol positif, calibrator  kedalam tabung reaksi.

b)    Dikocok sampai homogen.

c)     Dipipet 100 µl campuran tersebut dimasukkan ke dalam masing-masing sumur well.

d)    Diinkubasi selama 30 menit pada suhu  37⁰C.

e)     Dicuci masing-masing dengan larutan pencuci sebanyak 6 kali.

f)     Ditambahkan 100 µl enzim konjugat IgG.

g)    Diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37⁰C, kemudian dicuci 6 kali.

h)     Ditambahkan 100 µl TMB pada masing-masing well.

i)      Diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan.

j)      Ditambahkan 100 µl H₂SO₄ 2N.

k)     Dibaca absorban dengan ELISA Reader.

Perhitungan :

Cut off (CO) = Absorban calibrator x faktor (0,62)

Interpretasi hasil  :

- Negatif   : jika absorban < Cut off

- Positif    : jika absorban > Cut off

       IgM DHF

Metoda     : ELISA

Prinsip      : IgM DHF yang terdapat pada sampel akan berikatan dengan anti human IgM yang dilekatkan pada well sample. Kemudian ditambahkan HRP konjugat monoclonal antibodi (Mab) sehingga terbentuk senyawa komplek dan melepaskan peroksida yang bereaksi dengan chromogen membentuk senyawa berwarna biru yang intensitasnya sebanding dengan konsentrasi IgM DHF dalam sampel. Reaksi dihentikan dengan penambahan asam sulfat sebagai stop solution sehingga warna berubah menjadi kuning yang dibaca absorbannya dengan alat ELISA Plate Reader pada λ 450 nm dan 620 nm.

Alat dan bahan  :

-          Inkubator

-          ELISA Plate reader

-          Mikropipet 1000 µl, 500 µl, 100 µl, 50 µl dan 5µl

-          Rak well  beserta penutupnya

-          Reagen kit IgM DHF

-          Tip kuning

-          Washing solution

-          Sampel (serum)

Cara Kerja       :

a)     Dipipet 1000 µl serum diluent dan 10 µl sampel serum, kontrol negatif, kontrol positif dan calibrator  ke dalam tabung reaksi.

b)    Dikocok sampai homogen.

c)     Dipipet 100 µl campuran tersebut dimasukkan ke dalam masing-masing  sumur well.

d)    Diinkubasi selama 1 jam pada suhu  37⁰C.

e)     Dicuci masing-masing dengan larutan pencuci sebanyak 6 kali.

f)     Ditambahkan 100 µl enzim konjugat IgM.

g)    Diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37⁰C, kemudian dicuci 6 kali.

h)     Ditambahkan 100 µl TMB pada masing-masing well.

i)      Diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan.

j)      Ditambahkan 100 µl H₂SO₄ 2N.

k)     Dibaca absorban dengan ELISA Reader.

Perhitungan :

Cut off (CO) = Absorban calibrator x faktor (0,62)

Interpretasi hasil :

Negatif  : jika absorban < Cut off

Positif    : jika absorban > Cut off

       Pemeriksaan IgG dan IgM DHF

Metode            :  Rapid

Prinsip             : Human IgG dan IgM spesifik terikat pada protein-protein yang tidak bergerak dalam membran intra seluler yang terletak pada dua test garis individu (garis IgG dan IgM) dalam daerah test (T) dari alat uji. Garis IgM dalam daerah tes (T) adalah penutup dari lubang sampel dan diikuti oleh garis IgG dalam daerah tes. Protein virus dengue yang dikombinasikan dengan kemurnian tinggi adalah konjugat koloid partikel-partikel emas dalam patogen sampel. Serum sampel ditambahkan pada sumur sampel dari alat, antibody-antibodi (IgG dan IgM) dari virus dengue, jika terdapat dalam sampel akan membentuk kompleks warna garis tes IgM atau IgG. Salah satu tempat dalam daerah garis control (C) terlihat ketika tes telah terbentuk dengan tepat, tanpa memperhatikan ada tidaknya antibody anti virus dengue dalam sampel.

Cara Kerja       :

1)     Ambil Rapid Test Dengue letakan diatas meja.

2)     Gunakan pipet yang tersedia untuk menambahkan 5µl serum atau plasma sampel pada bagian tengah sumur sampel (S).

3)     Tambahkan 3 tetes atau lebih buffer pencuci dalam sumur sampel.

4)     Tunggu selama 5 – 10 menit

5)     Jika latar belakang membrane darah tes masih kemerah-merahan tambahkan 2 tetes atau lebih buffer pencuci pada sumur sampel (S) untuk membersihkan latar belakang membrane.

Catatan Penting :

Jangan pernah menambahkan lebih banyak sampel dalam daerah tes, lebih banyak sampel akan mempengaruhi hasil tes. Hasil tes mungkin dibaca segera 5 – 10 menit untuk reaksi spesifik IgG. Untuk IgM boleh selama 20 menit, karena titer IgM antibody yang rendah. Kadang-kadang garis positif IgM biasanya sangat terang atau lemah dari garis positif IgG, jika ada.

Interpretasi Hasil :

Ø Hasil Positif     :

·           dua garis merah muda keunguan pada daerah tes (G dan M) serta satu garis pada daerah kontrol (C) menandakan adanya antibodi IgG dan IgM spesifik yang melawan virus dengue.

·         satu garis merah muda keunguan pada daerah tes (M) serta satu garis pada daerah control (C) menandakan adanya antibodi IgM spesifik melawan virus dengue.

·         satu garis merah muda keunguan pada daerah tes (G) serta satu garis pada daerah control (C) menandakan adanya antibodi spesifik IgG melawan virus dengue.

Ø Hasil Negatif   :

satu garis berwarna merah muda keunguan pada daerah kontrol (C) menandakan tidak adanya antibodi spesifik yang melawan virus dengue atau jumlah antibodi di bawah tingkat sensitivitas pengujian.

Ø  Hasil Invalid (gagal):

Jika setelah 20 menit tidak ada garis yang nampak dalam daerah tes atau kontrol, maka hasil invalid. Prosedur yang sudah diikuti tidak benar atau telah terjadi kerusakan pada alat. Tes harus diulang dengan alat baru.